西双版纳傣族自治州普洱茶品质和功效研究
作者:邱明丰1,谢国祥1,叶茂1,苏明明1,贾伟2*(1.上海交通大学药学院和系统生物医学研究院,上海 200240;2. Department of Nutrition, University of North Carolina at Greensboro, North Carolina Research Campus, Kannapolis, NC 28081, USA)摘要:为科学评价西双版纳傣族自治州普洱茶的品质和功效,回答对普洱茶保健作用、存放年份无鉴别依据以及质量无科学评价标准的质疑,采用化学组学和UPLC-QTOFMS技术分析普洱茶的化学品质,经分析可区分茶的种类、普洱茶生熟类型、普洱茶贮存年份和不同品牌;采用代谢组学和UPLC-QTOFMS技术考察了普洱茶对人体代谢网络的影响,经分析发现饮茶后一些代谢物如5-羟基-色氨酸,3-氯酪氨酸,肌醇,肌酸酐等物质的相对含量产生显著变化,从代谢轨迹看,饮茶过程中代谢网络明显偏离正常组,饮茶停止后代谢组具有回调趋势。
关键词:普洱茶;化学组学;代谢组学;超高效液相色谱-飞行时间质谱法(UPLC-QTOFMS);化学品质;保健功效
云南省是中国古老的茶区、世界茶树原产地,西双版纳傣族自治洲的六大茶山是普洱茶原料的重要产地,云南西双版纳勐海茶厂是普洱茶生产知名厂家。本论文针对普洱茶的品质和功效,选择西双版纳傣族自治州代表性普洱茶,采用化学组学和代谢组学对该州提供样品进行了分析和研究。
1、仪器、试剂试药和样品
超高效液相色谱单级四极杆飞行时间串联质谱联用仪(UPLC-QTOFMAS)(Waters 中国有限公司)为主要检测仪器;试剂包括乙腈(Merck公司,色谱纯),甲醇(Merck公司,色谱纯),甲酸(Merck公司,色谱纯),Milli-Q超纯水;标准品包括L-白氨酸、甘氨酸、L-谷氨酰胺、牛磺酸等。
检测用普洱茶样品来自西双版纳勐海茶厂、云南昌泰茶叶集团、西双版纳勐腊县易武镇,绿茶“西湖龙井”来自浙江省杭州玉泉茶叶有限公司,“英国立顿红茶”来自香港联合利华有限公司。
代谢组学尿液样本来源于30名健康志愿者(男女各半),规范饮食,分别于茶前2周、饮茶2周、停茶后2周,每天定时收集并立即置于-80℃超低温冰箱。
2、 方法与结果
2.1 化学品质研究
2.1.1色谱条件:Waters BEH C18色谱柱(2.1 × 100 mm 1.7 μm);流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为0.1%甲酸乙腈;梯度洗脱;流速:0.40 mL/min;柱温45 °C;进样5 μL。
2.1.2 质谱条件:电喷雾离子源(ESI),采用正离子模式检测;脱溶剂气流量为600 L/h,脱溶剂气温度为400 ℃,锥孔气流量为50 L/h,离子源温度为100 °C,毛细管电压为3.5 kV,锥孔电压为35 V,微通道板电压为1800V。每0.1 S采集一次谱图;准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽(Leucine-enkephalin,m/z 556.2771)溶液为锁定质量溶液。质量扫描范围m/z 50-1000。
2.1.3供试液制备及检测:准确称取普洱茶、绿茶、红茶适量,加70%甲醇60°C超声提取,过滤,滤液高速离心(12000 rpm)15min,取上清液,稀释后进行UPLC/Q-TOF-MS分析。结果见图1,表明测定方法分离效果良好。
2.1.4数据分析:采用相应软件提取、自动谱峰判别,应用多维统计方法分析。
2.1.5结果与结论
从图1可以看到几种普洱茶与红茶样本间存在明显差别,如在保留时间为7.77分钟的位置,普洱茶样本有强度较大的峰,而红茶与绿茶这个位置的峰较小;保留时间为3分钟左右的位置,普洱茶的谱峰也与红茶、绿茶存在较大的差异;来3个普洱茶样本的总离子图也存在差异谱峰。
通过对标准物质谱图的比对与推测,得出普洱茶、红茶与绿茶中含有成分的比较如表1所示35个成分。其中,“+”为检出含有该成分,“-”为未检出该成分。由表1可见,普洱茶和红茶、绿茶之间化学品质不同,可以区分。
表 1
普洱茶、红茶与绿茶化学组学检测结果品种
普洱茶
红茶
绿茶
茶氨酸
+
+
+
儿茶素
+
+
+
表儿茶素
+
+
+
没食子儿茶素
+
+
+
表没食子儿茶素
+
+
+
儿茶素没食子酸酯
-
+
+
表儿茶素没食子酸酯
-
-
+
没食子儿茶素没食子酸酯
-
-
+
表没食子儿茶素没食子酸酯
-
-
+
茶黄素
-
-
+
槲皮素
+
+
+
山奈素
+
+
+
杨梅素
+
+
+
金鸡纳酸
+
+
+
没食子酸
+
-
-
苹果酸
+
-
-
丝氨酸
-
+
+
苏氨酸
-
+
+
门冬氨酸
+
+
+
吡咯型谷氨酸
+
+
+
苏丁糖酸
+
+
-
谷氨酸
+
+
+
谷胺酰胺
-
+
+
茶氨酸
+
+
+
葡萄糖
+
+
+
甘露糖
+
+
+
蔗糖
+
+
+
阿拉伯吡喃糖
+
+
+
咖啡因
+
+
+
缬氨酸
-
+
+
脯氨酸
-
+
+
苯丙氨酸
-
+
+
丙氨酸
-
+
+
亮氨酸
-
-
+
天冬酰胺
-
-
+
2.1.5普洱茶与红茶、绿茶的比较.1.
为使分析结果更加直观可靠,且具有统计学意义,采用非监督的PCA的方法,观察不同茶样的整体特征,结果如图2。在PC1维上可以看到普洱茶样本与红茶、绿茶的样本的有明显分离趋势,提示普洱茶的总体化学成分与红茶、绿茶都存在着显著差异;红茶与绿茶之间能在PC2维上明显分离,而普洱茶样本之间也能在PC2维明显分为两组,提示普洱茶样本本身分为两种有明显区别的类别,回溯样本编号发现,在PC2维上将普洱茶样本分为了普洱茶熟茶与普洱茶生茶;普洱茶熟茶与红茶在PC2维上属于同一象限,普洱茶生茶与绿茶在PC2维上属于同一象限。
2.1.5普洱茶生茶和熟茶的比较.2.
按照前述数据处理与计算方法,将不同类型的普洱茶茶样的UPLC/Q-TOF-MS谱图数据进行O-PLS-DA模型计算,结果发现普洱茶生茶与熟茶两者之间能很好的区分开来,见图3。
由于UPLC/Q-TOF-MS给出的差异变量比较多,为便于分析,作了不同类型普洱茶的差异性物质的的S-plot示意图(图4),找出了9个主要差异性变量:普洱茶熟茶与生茶比,茶氨酸(Theanine)、苏氨酸(Threonine)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin)、儿茶素(Catechin Hydrate)、没食子儿茶素没食子酸酯(Gallocatechin Gallate)阿拉伯吡喃糖(Arabinopyranose)、表儿茶素(Epicatechin)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin Gallate)、槲皮素(Quercetin)的含量均降低。
3. 普洱茶贮存年份比较
采用非监督的PCA的方法,观察不同存放时间的普洱茶样的整体特征,结果如图5所示。在PC1维上,普洱茶样本的UPLC/Q-TOF-MS谱可基本按存放时间的长短进行分离。同一年份的普洱茶生茶和熟茶在PC2维上明显分离。以上PCA的分析结果表明,虽然普洱茶因生茶和熟茶的种类不同存在着化学特征的明显差异,但这两种类别的普洱茶的品质都有随存放时间变化的趋势。
4. 不同品牌比较
将全部普洱茶样本的UPLC/Q-TOF-MS谱图按产地进行PCA分析,发现三个产地的普洱茶样本有一定分离趋势,但并不非常显著。其中,大益牌普洱茶与昌泰、易武普洱茶在PC1维上处于不同象限,提示他们之间的区别较大。
2.2 普洱茶保健功效研究
2.2.1普洱茶泡制
大益牌普洱茶5年熟茶。每日取普洱茶样品300g用6L开水泡10分钟即得 (每人每日饮10g /200ml)。
2.2.2 代谢组学试验志愿者信息
本试验通过公开招募和体检,选择了30名年龄在22至32岁间,无病史,无烟酒等不良嗜好的健康志愿者(男女各半)。经伦理委员会批准,志愿者在充分了解本试验流程和潜在风险并自愿参加的情况下签订受试者知情同意书及登记个人与健康体检信息,并承诺遵守实验守则。
2.2.3 尿样收集
选择30正常人群(男女各半),规范统一饮食,分别于茶前2周、饮茶2周、停茶后2周,每天定时收集尿样,置于-80℃冰箱备用。
2.2.4供试液制备方法及检测
收集的尿样,每份取1mL, 以13000 rpm离心10分钟后,取500 µL上清液,用超纯水稀释至1mL,同前进行UPLC-TOFMS测定,健康人群在饮用普洱茶的前(A)、中(B)、后期(C)的尿样UPLC/Q-TOF-MS基峰色谱图7。
2.2.5结果与讨论
2.2.5.1普洱茶饮茶前、饮茶中、饮茶后健康志愿者尿样的PCA分析
测定了饮茶前(第0、7天),饮茶中(第16、21、28天)及饮茶后(第30、36、42天)的尿液样本,图7中A和B和C分别为是饮茶前,饮茶中及饮茶后尿液样品UPLC/QTOFMS基峰色谱色谱图。基峰色谱图直观观察,可以发现三个阶段之间尿液组成的成分和比例上发生了较明显的变化。
UPLCQTOF图谱经数据经转换以及多维统计后,得到PCA分析结果,如图8所示,饮茶前,饮茶中及饮茶后尿液样品可以在PCA得分图的PC1维上明显区分开来,提示饮用普洱茶造成了机体的代谢网络的明显变化,发现在饮茶前0天及7天时,志愿者处在基础状态,经过14天的普洱茶饮用,在PCA图上呈现随着饮用时间变化而显著变化的轨迹。饮茶后,志愿者的尿液样本与基础期在PC2维上近似,PC1维上可明显区分,提示饮用普洱茶后机体代谢网络偏离基态的趋势仍然继续,并呈显缓慢向基态回归的趋势。
2.2.5.2 饮茶前、饮茶中健康人群的O-PLS-DA分析及差异性物质鉴别
运用O-PLS-DA分析方法,选择男女各10人,考察了饮茶前及饮茶过程中两个时间点(即第7天与第21天)的O-PLS-DA模型,见图9。结果表明,尽管健康人群的代谢组在规范饮食后仍存在明显的性别差异性,但两个时间点可进行显著分离,提示饮用普洱茶是造成机体的代谢网络发生明显变化的主要影响因素。据文献报道,饮食成分及与昼夜节律相关的代谢物能将尿液样本的收集时间区分开来。因本实验在设计时用标准饮食和固定的尿液收集时间避免了这两个因素,故能更好的反映我们想要研究的摄入普洱茶对机体的代谢网络的影响。
利用Splot模型(图10),找出了饮茶前、饮茶中不同时间点健康人群尿样UPLC/Q-TOF-MS谱的7个主要的差异性物质。即在持续饮用普洱茶一段时间后,健康人群尿样中的肌醇(Inositol)、肉豆蔻酸(Myristic acid)、5-羟基-色氨酸(5-Hydroxy-tryptophan)、4-甲氧基苯乙酸(4-Methoxyphenylacetic acid)含量升高,肌酸酐(Creatinine)、3-氯酪氨酸(3-chlorotyrosine)、酪胺(Tyramine)含量降低。
在这些差异代谢物中,饮茶后肌醇含量显著升高,同时3-氯酪氨酸含量显着性降低。相关生物化学数据库信息显示,肌醇在人体的生理过程中具有降低脂肪酸和胆固醇的作用,饮用普洱茶后升高的肌醇浓度,是饮用普洱茶产生降低胆固醇作用的机制之一。而3-氯酪氨酸能显著提高人动脉粥样硬化内膜的低密度脂蛋白,3-氯酪氨酸的降低导致低密度脂蛋白降低,相应地提高了高密度脂蛋白与血清蛋白的比值,是普洱茶具有降血脂功能的机制之一。
参考文献
Chen M, Su M, Zhao L, Jiang J, Liu P, Cheng J, Lai Y, Liu Y, Jia W. Metabonomic study of aristolochic acid-induced nephrotoxicity in rats . J Proteome Res. 2006, 5(4): 995-1002.
Carolyn M. Slupsky, Kathryn N. Rankin, James Wagner, et al.Investigations of the Effects of Gender, Diurnal Variation, and Age in Human Urinary Metabolomic profiles . Analytical Chemistry A, 08/17/2007
http://www.hmdb.ca/
吴文华,等. 普洱茶多糖降血脂功能的量效关系. 福建茶叶, 2006, 2: 42-43.
项目组长贾伟教授简介
贾伟教授,男,full professor,director,Department of Nutrition,University of North Carolina at Greensboro,North Carolina Research Campus,Kannapolis,NC 28081,USA,主要研究方向为中药系统生物学(代谢组学)研究,中药及天然药物的新药开发。
1991年和1996年分别获美国密苏里大学硕士、博士学位。1992年在硕士毕业后即受聘全日制工作,历任美国密苏里大学原子能研究所放射药物部研究员、医用同位素和放射药物项目经理、高级项目经理、部门主管;1996年受聘于美国BEST 国际医学公司担任技术和商业发展部部门主管;1999年回国担任中国沃芬医药(香港)有限公司首席科学家至今;2001年应聘担任天津大学药物科学与技术学院教授、常务副院长,并开始从事中药现代化研究;2003年起担任上海交通大学药学院教授、副院长。2004年获教育部跨世纪优秀人才计划,2005年获上海市教委曙光人才计划,2006年起兼任上海交大系统生物医学研究院首席科学家。迄今发表国际、国内论文70余篇(影响因子6.92的文章2篇,影响因子21的文章1篇),专著3部(主编《药物控释新剂型》、《生物资源中活性物质的开发与应用》等),国际、国内发明专利27项。作为项目负责人承担了国际、国内各种新药包括现代中药类研究项目20余个,其中包括一个治疗癌症骨转移的创新药物(US Patent No. 5902825)、二个上海市重大基础研究项目。目前还担任9家国际、国内学术期刊编委。国家自然科学基金中药类项目评委、国家新药审评专家、香港卫生福利及食品局中医药项目评审人、上海市科委中药现代化项目专家、数家大型医药企业董事、技术顾问。
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基金项目:西双版纳傣族自治州人民政府和上海交通大学州校合作项目
*通讯作者: 贾伟,Email: w_jia@uncg.edu
好文章,学习了good 太专业了,看不懂呀!能不能附一个简单的研究结果 第1遍,没看太懂,再看。。。。。。。。。! 原帖由 实心沱 于 2009-1-14 16:08 发表 http://bbs.puerh.cn/images/common/back.gif
太专业了,看不懂呀!能不能附一个简单的研究结果
同意! 俺看出的结论如下:
普洱茶的总体化学成分与红茶、绿茶都存在着显著差异~
熟茶里的好东西比生茶少了~
生茶熟茶的品质都有随存放时间变化的趋势~
三个产地的普洱茶有点区别,大益的区别大一些~(我猜是拼配的缘故~:titter )~
普洱茶具有降血脂功能,尤其对降低胆固醇和低密度脂蛋白有效~
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